本来一切都已经安排得妥妥当当、天衣无缝，哪知道当初山阳知县王伸汉到善缘庵验尸时，忽视了一张收在李毓昌身穿的皮马褂内的禀帖，也就是后来李毓昌遗孀林氏检出的稿中有“山阳知县冒赈，以利陷毓昌，毓昌不敢受，恐上负天子”字样的残稿。而后来淮安知府王毂验过尸以自杀结案后，李祥等人为李毓昌装殓，将皮马褂脱了下来，收在一边，李毓昌叔父李泰清到来后，便作为遗物交给了李泰清。带血的皮马褂和禀帖残稿后来成了开棺验尸的有力凭证。
在山东即墨，当林氏和李泰清发现李毓昌死于被害后，悲痛难名，决意为亲人申冤。刚好这个时候，另一即墨官员初彭龄回到老家探亲。
初彭龄，乾隆四十五年（1780）进士，以“清介”自许，以“报称”为心，素来以耿直敢言而闻名于朝野。就在三年前，铁保新任两江总督、初彭龄调任安徽巡抚之时，寿州发生了一起特大命案：武举张大有与侄子张伦争夺女人，投毒将张伦及一名雇工害死。因张大有家境富有，通过苏州知府周锷打通了两江总督铁保的关节，最后以张伦等被毒蛇咬伤致死定案。结果初彭龄从中发现了端倪，查出真相后，张大有伏法，铁保也因为失察褫官衔、降二品顶戴，虽然铁保不久又官复原职，但初彭龄不畏权贵的美名却是传开了。
初彭龄与李毓昌同籍，曾有师生之谊，得知李毓昌英年而逝后既感愕然，又深为惋惜。李泰清趁机将李毓昌之死的种种可疑之处告诉了初彭龄。初彭龄听后义愤填膺，立即亲写诉状，敦促李泰清携诉状到京师都察院（清代最高的监察、弹劾及建议机关）去控告。
就在李泰清及李士璜（李毓昌堂伯）要离开山东赴京告状之际，初彭龄又派人通知李泰清，要他立即将李毓昌灵柩在堂屋中就地掘坑深埋，以防有人前来窃尸焚骨，失去最关键的凭证。初彭龄久经宦途，饱经世故，对官场的险恶了如明镜。果然，就在李毓昌灵柩被深埋后的几天，听到风声的王伸汉派“盗贼”前来窃尸，但已经晚了一步，李毓昌灵柩已经被深埋入窖。“盗贼”无法下手，只好取走李氏大门前的旗杆顶子，以此为凭据回报王伸汉。
嘉庆十四年（1809）五月初，李泰清和李士璜到达北京，立即赶到位于紫禁城天安门（即明朝的承天门）前的宫廷广场西侧宫墙外的都察院具控喊冤。左都御史特克慎接了诉状，李泰清将事情经过告知，并将血衣、禀帖残稿、银簪等证物呈上。特克慎一听说新科进士、朝廷命官李毓昌被人谋杀，显见案情复杂，便暂时收了诉状，没有明确表态。
几天后，初彭龄也到达北京。他此行的主要目的是回京述职，但也十分关心李毓昌一案。回到北京当天，初彭龄赶到都察院询问李毓昌案情。特克慎并不知道诉状其实就是初彭龄所写，正想了解案情经过，认为初彭龄与李毓昌同乡，肯定知道内情，便将诉状交给他看。初彭龄假装看完诉状，说：“李毓昌是莱州府人氏，我祖籍本是登州府，并非同乡。”他这样说，则可以有效地避嫌。特克慎果然征询初彭龄的处理意见。初彭龄说：“李毓昌是朝廷命官，竟然被人谋害，此案重大之极。可事关其他朝廷命官，难免棘手。不如将诉状呈上，请皇上御批最为妥当。”特克慎深以为然。这样，在初彭龄的巧妙安排下，李毓昌命案被直接送到了嘉庆皇帝面前。
前面已经详细讲过嘉庆皇帝当时内外交困的处境，他正为吏治腐败、朝廷官员贪风泛滥而焦头烂额，接到都察院呈递的李毓昌命案诉状后，当即火冒三丈，立即下了两道圣谕：一是命山东巡抚吉纶立即派精干大员到即墨把李毓昌尸棺运到省城详验；二是命两江总督铁保及江苏巡抚汪日章将山阳知县及有关人证火速解京，由军机大臣会同刑部直接审讯。为了防止出现类似之前铁保徇私舞弊的情况，嘉庆皇帝在谕旨中特意强调说：“若不悉心研鞫，致凶手漏网，朕断不容汝辈无能之督抚，唯执法重惩，决不轻恕！”
山东巡抚吉纶之前已经因为在失察仓书舞弊一案中被降二级留任，此次接旨后不敢怠慢，一面调集精兵强将组建成验尸团，其中包括山东布政使朱锡爵、山东按察使张彤、济南知府徐日簪、武定知府金国宝、登州知府石俊、历城知县王嵩、嘉祥知县周以勋、德州知州周履端、阳谷知县王吉，这九名省、府、州、县官员作为监验官，一面派出人马赶到即墨调运李毓昌尸棺到省城济南。
尽管天子亲自批示要调查此案，山阳知县王伸汉仍然在作最后的努力。当吉纶派出的人马在即墨重新挖出李毓昌尸棺时，王伸汉的亲信包祥已经赶到济南，出重金买通了将要为李毓昌验尸的仵作。同一时间，李泰清等人也赶回了即墨，准备参与取棺验尸。只是他们对仵作已经被王伸汉买通一事尚懵然不知，完全蒙在鼓中。一方面是皇帝严查命案的圣旨和亲人为死者申冤的决心，一方面是凶手不肯坐以待毙的挣扎，案情由此更加复杂，真相还能大白于天下吗？
六月十一日，在山东布政使朱锡爵、寿光县县丞王会图、安丘县县丞杨遇春、即墨县知县谭文谟和李毓昌亲属李泰清、李毓奎、李毓庄等人的押护下，李毓昌尸棺到达山东省城济南南门外校场。校场已经搭好席棚、设下案桌，做好了验尸的准备。
六月十二日，验尸开始。此时，李毓昌死亡已经有八个月之久，尸体早已开始腐烂，从身体表面已经无法看出是毒杀还是上吊自杀。经过商议，监验官决定按宋代著名法医学家宋慈名著《洗冤录》中的蒸骨法进行蒸骨验尸。而这一点早已为山阳知县王伸汉所料到，他让买通的仵作在验尸时暗中放入了咸盐。这样，在盐的作用下，骨头蒸完后呈现绵白色，看上去并没有中毒迹象。
在场监验官无不面面相觑，如此大费周折，甚至惊动了皇帝，众人都以为必然是一桩大冤案，谁料竟然还是要维持原判。幸好此时李泰清上前尝了验尸的蒸骨水，发现有咸味，于是痛哭不已，要求重新蒸验。山东布政使朱锡爵同意了，他很有心机，第二次蒸验正要开始的时候，他突然叫停，走上去亲尝蒸骨水，发现仍然有咸味。至此，仵作作弊一事败露。朱锡爵大怒下，命人当场将作弊仵作杖毙。另取干净水蒸骨后，骨头全黑，李毓昌中毒已经是确认无疑。
不过此时又有新的疑点出来：新蒸骨骸中龟子骨仅呈微青色，而心坎骨又全无青色，这是怎么一回事？当场有名经验丰富的仵作对此解释说：“人中毒后，毒先入四肢，毒气攻心才能毙命。死者肯定是先中毒，但毒气还未攻心之前，他已经被勒颈而死。这样一来，毒气没有到达心尖，所以心坎骨无青色。”
这样的解释合情合理，但又有新的问题冒了出来：那就是李毓昌中毒后，到底是自己上吊还是被他人勒死后吊上屋梁？本来，在中国历史上，用上吊自杀来掩饰勒杀的情况非常普遍，《洗冤录》中记载有可以通过检验勒痕的做法来识别，通常勒杀后再吊上屋梁会在脖子上留下两道勒痕，还有一些其他迹象明显区别于自己上吊。但此时李毓昌尸体已经腐烂，无法从勒痕来辨别，监验官只能完全靠分析推理来解决疑惑。如果是李毓昌自己上吊，那么他的口鼻怎么会出血？即使是口鼻出了血，一个上吊之人又怎么会用自己的马褂衣袖去擦血迹呢？如此推断起来，李毓昌必然是他杀，但事实经过如何，就需要人犯的口供来证实了。
至此，山东济南这边的验尸工作在历经波折后终于结束，验尸经过和结果被如实上奏朝廷，李毓昌尸骨也被重新装殓运回即墨。
而另一边李毓昌命案的案发地江苏也早忙成一团，两江总督铁保和江苏巡抚汪日章派出大批人马缉捕涉案人犯。李毓昌长随李祥、顾祥，淮安知府王毂，山阳知县王伸汉及其长随包祥、张祥、余升，厨子钱升等先后被捕，解往京师。
李毓昌另一长随马连升本被王伸汉推荐到宝应县任职，但他自从害死主人后难以自安，没有到职便躲回了山东聊城老家。不过，他家中贫困，无以为生，后又不得不到京师谋生做长随。李毓昌案发后，震动朝野，马连升惶恐无助，干脆主动到刑部投案自首。
七月初三，全部人犯都解到了京师，由刑部收监，会同军机处严审。由于铁证如山，经过多次对质后，案情已经真相大白，各案犯均低头认罪。谋害李毓昌的元凶王伸汉也供认了吞赈在前、行贿在后及杀人灭口的全部过程。
据清人梁恭辰在《北东园笔录初编》中记载，王伸汉本来拒不认罪，有一天熬跪倦极，便向审讯官员求一杯茶喝。审讯官员命左右端了一杯茶给他，不料他接过茶后并不喝，而是瞪着茶杯良久。也许是他想到了当初李毓昌喝毒茶的情形，这之后，王伸汉便吐实招供了。
这期间还发生过一场自杀的戏剧性场面。淮安知府王毂深知罪责难逃，决意自杀。他将随身带的玻璃小镜砸碎后，用碎片划伤了自己的腹部和颈部。但很快被狱卒发现，救治了过来。不过当班狱卒也因为疏于防守被“交部察议，各行研鞫”。
更可笑的是，涉案人犯已经在北京认罪后，两江总督铁保竟然还糊里糊涂地上奏说：“此事尚毫无端倪，容再加体访具奏。”又说：“铺叙鬼神之词（指李毓昌托梦给妻子林氏一事）以为破案之来历。”本来他跟李毓昌命案并无直接干系，但他模棱两可、醉生梦死的态度彻底激怒了嘉庆皇帝，决定拿此案开刀，将这位总督一并处置，以达杀一儆百之效。
嘉庆十四年（1809）七月初十，审理结果下达：谋杀李毓昌之主犯王伸汉立即处斩，并抄没家产，其长子流放乌鲁木齐；长随包祥刑夹后斩首；李祥、顾祥、马连升三人因谋害主人，属于大罪，按“雇工人谋杀家长，照子孙谋杀祖父母者，皆凌迟处死”。受贿的淮安知府王毂绞立决；为李毓昌验尸的仵作李标杖一百，流放三千里；派往山阳的查赈委员除李毓昌、章家璘拒绝贿赂外，其余九人均因受贿被流放，且抄没家产；除此之外，嘉庆皇帝亲谕定论处罚五名朝廷大员：两江总督铁保革职，流放乌鲁木齐；江苏巡抚汪日章革职回籍；江宁布政使杨护降职，留河工效力；江宁按察使胡克家革职，留河工效力；淮扬道道台叶观潮革职留任。
而死去的李毓昌被赏加知府衔，优厚安葬。嘉庆皇帝亲制《悯忠诗》五排三十韵，刻石立于李毓昌墓前。李毓昌之嗣子李希佐被赐举人身份，允许直接参加会试。李毓昌叔父李泰清也被封为武举。